小鼠生化位點檢測

乙酸纖維薄膜電泳是生物化學(xué)的方法，該技術(shù)運用于實驗動物遺傳質(zhì)量控制只有二十余年的歷史。由于該方法能檢查近20對等位基因，涉及十幾條染色體，利于反映被檢品系的遺傳概貌，所以，目前認(rèn)為此法靈敏度高，準(zhǔn)確性強，檢出速度快，用樣量小，是遺傳檢測諸方法中較為理想的一種。

一、實驗器材

1．樣品

(1)血清：用于Es-1和Trf兩位點檢查。

(2)溶血清：用于檢查Hbb、Car-2和Ldr-1位點。

(3)腎勻漿：用于檢查Es-2、Es-3、Idh-1、Mod-1、Akp-1、Pgm-1、Pep-1、Gpd-1、Gpi-1、Ce-2位點。

(4)尿液：一般在早上8～9時取鼠原尿，做一倍稀釋后方可使用，用于Mup-1位點的檢查。

2．緩沖液：略。

3．染色液：略。

4．點樣品一套，電泳儀一臺，電泳槽一個，乙酸纖維薄膜若干張。

5．滴管、管架、直徑10cm培養(yǎng)皿、普通濾紙、燒杯各二個。

二、實驗方法和步驟

1．實驗方法

我們采用的是水平乙酸纖維薄膜電泳法即用普通濾紙做鹽橋，在低溫常壓下的電泳。

2．實驗步驟

(1)把電泳緩沖液加入電泳槽內(nèi)到紅線位置，鹽橋濾紙對折后用訂書機將其同定在橋架上，然后加蓋置于4℃冰箱或相應(yīng)冷室里預(yù)冷。

(2)從低溫(-20℃)冰箱中取出樣品，于室溫下自然解凍，并同時將乙酸纖維薄膜裁成適當(dāng)大小投入緩沖液中浸泡濕透。

(3)從緩沖液中取出乙酸纖維薄膜夾于兩張普通濾紙間，用手輕壓濾紙，以吸去薄膜上的多余緩沖液。

(4)樣品解凍后，用彎頭滴管吸取少量樣品液于點樣板上的小方格內(nèi)，并依序記下樣品號碼，再用點樣刷蘸取適量樣品液點在乙酸纖維薄膜粗糙面距邊緣1.5cm處，之后迅速轉(zhuǎn)入電泳槽內(nèi)，按規(guī)定方向(緩沖液pH值大于5.6的，樣品的電泳方向是由負極向正極泳動，若pH值小于或等于5.6則由正極向負極泳動)把點上樣的薄膜水平搭在鹽橋上，待調(diào)整好位置后加蓋飽和1～2min，接通電泳，選擇適當(dāng)電壓和電流并按規(guī)定時間電泳。

(5)時間到后立即將電壓電流選擇調(diào)零和關(guān)掉電源，依次取出走完的乙酸纖維薄膜，放入相應(yīng)的染色液中，染色5min后取出于5％乙酸溶液脫色1～2h，或直到電泳帶背影清楚為止，自然風(fēng)干后，照相或透明等處理，易于長期保存。

三、結(jié)果分析

結(jié)果分析指的是電泳帶型的確定。我們知道，每個品系都有自己固定的電泳帶型，這個原始的固定電泳帶型稱作該品系的標(biāo)準(zhǔn)型。品系間各位點的標(biāo)準(zhǔn)型有的相同，有的則不同；而品系間生化位點的標(biāo)志相異對于電泳帶型的確定是很有用的。在實際工作中，由于DBA／2和C57BL兩品系小鼠的多數(shù)生化位點標(biāo)志都不相同，故在生化位點檢查時將其用作確定待知鼠電泳帶型的參照物來使用。

一般在電泳時，總是把待測樣品和已知標(biāo)準(zhǔn)型樣品在同樣條件和同一支持物上走電泳的，這樣待測作品就可與標(biāo)準(zhǔn)型樣品的帶型進行對比了，以此即可確定待測樣品的帶型。例如我們把特測樣品和已知標(biāo)準(zhǔn)的DBA／2和C57BL品系的樣品同時走Car-2電泳，其待測帶型如果跟DBA／2一樣則為b型，若和C57BL的一樣就是a型，要是即同DBA／2，又同C57BL，那么它就是混雜帶型。

注意：對于一個單位來講，*次檢查應(yīng)該是的，特別是新引進的或新培育的品系更應(yīng)如此。但如果這個單位已進行過一次檢測后，隔一段時間。要對已查過的品系進行再復(fù)查時，若做生化位點檢測，可只測臨界位點，即Car-2、MuP-1、Hbb、Es-1、Trf和Es-3。這樣可節(jié)省人力和物力。